Генная инженерия растений
2 слайд. Генная инженерия - это совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Цель этих приёмов - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки
3 слайд. Agrobacterium - род грамотрицательных аэробных бактерий.Способны вызывать образование галлов (опухолей) у многих растений.
Введение генов в клетки растений - основные способы:
○С помощью Agrobacteriumtumefaciens
■прямой физический перенос ДНК в клетку:
▪ бомбардировка микрочастицами
▪ электропорация;
▪ обработка полиэтиленгликолем;
▪ перенос ДНК в составе липосом
Для трансформации устойчивых ("рекальцитрантных") к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку, многие из которых взяты из практики работы с клетками бактерий или животных. Эти методы достаточно разнообразны, они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др.
Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно, впрочем, трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы - хлоропласты и митохондрии.
4 слайд. В генной инженерии используются:
| Корончатый галл Agrobacteriumtumefaciens (Ti-плазмиды) | Бородатый корень Agrobacteriumrhizogenes (Ri-плазмиды) |
A. tumefaciens вызывает образование опухолей стебля двудольных растений - так называемых корончатых галлов. Бактерии прикрепляются к клетками растения в местах повреждений. Сайтами связывания на поверхности бактерий являются молекулы β-глюкана и О-антигенной цепи липополисахарида внешней мембраны.
Способность A. tumefaciens индуцировать у растений образование опухолей типа "корончатого галла" коррелирует с наличием у них Ti-плазмиды. Опухолевая трансформация проявляется в гипертрофии возникающей после проникновения агробактерий в пораненные участки (сайты) растений (рис. 1). Трансформация является результатом стабильного ковалентного включения (инсерции или интеграции) сегмента («transferred» или Т-ДНК) большой плазмиды (pTi - tumorinducing или pRi — rootinducing) бактерий в ядерную ДНК растительной клетки.
Другой вид агробактерий – A. rhizogenes, - вызывает заболевание, именуемое "бородатый корень", при котором в зоне повреждения корня образуется масса новых корешков. A. rubi обычно индуцируют неорганизованные опухоли (тератомы), штаммы A. radiobacterавирулентны
Наиболее подробно изучены опухоли — корончатые галлы, индуцируемые Agrobacteriumtumefaciens. Они представляют собой истинно злокачественные опухоли, которые могут расти в культуральной среде в отсутствие стимуляторов роста — фитогормонов, необходимых для роста нормальных тканей.
Опухоли можно поддерживать в течение многих лет invitro, и при их использовании они способны вызывать опухоли у здоровых растений. В природных условиях корончатые галлы образуются в месте соединения корня со стеблем (у корневой шейки), откуда и произошло их название корончатый галл. Однако корончатые галлы могут развиваться и на подземных частях растения, например на корнях плодовых деревьев, и на надземных, например на стебле винограда.
В лаборатории эти заболевания можно вызвать у здоровых растений экспериментально, путем инфицирования их бактериями. Растения перед инокуляцией должны быть поранены, при этом опухоли возникают в поврежденных сайтах растения, обычно на стебле или листьях растения. Кроме целых растений в качестве тест-объектов используются экспланты, например ломтики моркови и кусочки других органов растений.
Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксина и цитокининов.
5 слайд. Генетическая трансформация
растения A. tumefaciens
слайд. Метод «промежуточных векторов»
метод «промежуточных векторов» (коинтегративных векторов) — основан на использовании плазмиды кишечной палочки pBR 322 (рис. 2).
Рис. 2. Создание коинтегративного вектора на основе Тi-плазмиды: Рр - расщепление рестриктазой
Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмидуpBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полнуюTi-плазмиду.
Между Т-сегментами нативнойTi-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативнуюTi-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.
7 слайд. Основные направления генной инженерии растений
• Организмы с новыми свойствами
• Организмы, устойчивые к вредителям
• Продуценты белков и других веществ