III. Промикроскопировать демонстрационные препараты стрептококков, бацилл сибирской язвы, окрашенные по методу Грама и полученные результаты занести в протокол.
Ожидаемые результаты: Streptococcus spp. Препарат из бульонной культуры. Грам (+) полиморфные кокки диаметром 0,5-1,5 мкм, расположенные, в основном, цепочками.
Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы, препарат из бульонной культуры. Грам (+) крупные палочки (5-10 х 1-2 мкм) с обрубленными концами, расположенные длинными цепочками в виде “бамбуковой трости”.
ОБРАЗЕЦ ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ
Протокол-отчет№ ____от________Ф. И. О.____________№ группы________
ТЕМА:
Цель | Метод и его содержание | Полученные результаты | Выводы |
Вопросы для самоконтроля:
1. Назовите отличительные признаки микроорганизмов, как представителей царства прокариот.
2. Какие свойства микроорганизмов лежат в основе микроскопического метода исследования?
3. Назовите и обоснуйте какие методы окраски микроорганизмов (простые или сложные) являются более информативными.
4. Обоснуйте дифференциально-диагностическое значение метода Грама в микробиологической практике.
5. Обоснуйте необходимость использования иммерсионной системы для изучения микроорганизмов.
Литература:
Учебники:
1. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С.28-30, 43-44, 50-52, 255-260.
Лекции по микробиологии.
Тесты.
ЗАНЯТИЕ 2 Леч., пед. ф-ты, 2006
ТЕМА: Структурные элементы бактериальной клетки.
Цель: На основе знаний структуры бактериальной клетки уметь идентифицировать и дифференцировать микроорганизмы.
Знать:
6. Морфологию и структуру бактериальной клетки.
7. Назначение отдельных элементов бактериальной клетки.
8. Методы окраски различных структур бактериальной клетки.
Уметь:
4. Окрашивать препараты методами: Зырянова (выявление капсул), Тружильо (выявление спор), Нейссера (выявление зерен волютина).
5. Микроскопировать, идентифицировать и дифференцировать микроорганизмы с учетом морфологии и структурных особенностей; интерпретировать полученные результаты.
Контрольные вопросы:
1. Основные различия в ультраструктуре клеток прокариотических и эукариотических микроорганизмов.
2. Обязательные и необязательные структуры бактериальной клетки.
3. Особенности строения нуклеоида, рибосом у бактерий.
4. Особенности строения и состава клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Метод ее изучения.
5. Субклеточные формы микроорганизмов: протопласты, сферопласты, L-формы. Причины их образования, биологические особенности, патогенетическое значение.
6. Капсулы, споры, зерна волютина, жгутики: химический состав, функции, методы изучения.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Приготовить фиксированный препарат из культуры №1, окрасить по методу Зырянова, промикроскопировать. Полученный результат внести в протокол и сделать вывод.
2. Приготовить фиксированный препарат из культуры №2, окрасить по методу Тружильо, промикроскопировать. Полученный результат внести в протокол и сделать вывод.
3. Приготовить фиксированный препарат из культуры №3, окрасить по методу Нейссера, промикроскопировать. Полученный результат внести в протокол и сделать вывод.
4. Промикроскопировать демонстрационный препарат из культуры №4, окрашенный по методу Лейфсона. Полученный результат внести в протокол и сделать вывод.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
1. Приготовление препарата из культуры №1 с плотной питательной среды. Окраска по Зырянову для выявления капсул.
Приготовьте 2 стекла: обычное предметное и стекло со шлифованным краем. На обезжиренное стекло (ближе к его правому краю) нанесите каплю сыворотки, внесите в нее исследуемую культуру №1 и тщательно суспензируйте. После чего сделайте тонкий мазок. Для этого прикоснитесь к капле сыворотки с культурой краем шлифованного стекла, установленного под углом 45° и легким, быстрым движением, прижимая шлифованное стекло, продвиньте его влево по предметному стеклу, не доходя 1-1,5 см до края. Мазок высушите на воздухе, зафиксируйте в смеси Никифорова (1 часть спирта + 1 часть эфира) в течение 15 мин, после чего окрасьте карболовым фуксином Циля, погрузив его в стакан с краской на 5-10 с. Затем препарат осторожно промойте водой, промикроскопируйте с иммерсионной системой. Полученный результат занесите в протокол и сделайте вывод.
Ожидаемый результат: в препарате на розовом фоне видны бактерии (описать их морфологию), окруженные неокрашенным ободком - капсулой. Метод Зырянова относится к негативным методам выявления капсул; которые в виду высокого содержания воды обладают низким сродством к красителям.
2. Приготовление фиксированного препарата из культуры №2, растущей на плотной питательной среде. Окраска по Тружильо для выявления спор.
Приготовьте фиксированный препарат из исследуемой культуры. На препарат поместите полоску фильтровальной бумаги, смочите 0,5% раствором малахитовой зелени, подогрейте над пламенем горелки до отхождения паров и затем остудите. После чего опять добавьте краску и вновь подогрейте до отхождения паров. Процедуру повторите еще 1-2 раза так, чтобы общее время окраски препарата составляло не менее 7 мин. Остудив препарат, тщательно промойте его водой и докрасьте 0,25% раствором фуксина в течение 2 мин; снова промойте водой, высушите фильтровальной бумагой и промикроскопируйте с иммерсионной системой. Полученный результат занесите в протокол и сделайте вывод.
Ожидаемый результат: споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативные формы – в розовый. Споры бактерий имеют многослойную непроницаемую оболочку, поэтому для их окраски используют «агрессивные» методы, предусматривающие прогревание (метод Тружильо), прогревание и протравливание кислотой (метод Ожешко, метод Циля-Нильсена).
3. Приготовление препарата из культуры №3, выращенной на жидкой или плотной питательной среде. Окраска по Нейссеру для выявления зерен волютина.
Приготовьте фиксированный препарат из исследуемой культуры. На препарат нанесите уксусно-кислую синьку Нейссера на 1 мин, после чего краску смойте и нанесите раствор Люголя на 30 с, который слейте и докрасьте препарат водным раствором хризоидина в течение 15 с, промойте водой и высушите фильтровальной бумагой. Промикроскопируйте с иммерсионной системой. Полученный результат занесите в протокол и сделайте вывод.
Ожидаемый результат: зерна волютина окрашиваются в темно-синий или черный цвет, а клетка – в желтый. Это связано с тем, что зерна волютина, содержащие полифосфаты, имеют в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию и избирательно воспринимают уксусно-кислую синьку.
4. Промикроскопируйте демонстрационный препарат из культуры №4. Окраска по Лейфсону для выявления жгутиков. Полученный результат занесите в протокол и сделайтевывод.
Окраска жгутиков по Лейфсону: петлей забирают микробную массу из конденсата 18-часовой агаровой культуры и вносят в пробирку с 2 мл дистиллированной или водопроводной воды. Не взбалтывая и не встряхивая, ждут, пока вода не помутнеет, после чего суспензию оставляют в штативе на 5-7 мин. Тем временем на хорошо обезжиренном стекле восковым карандашом рисуют прямоугольник, занимающий 2/3 стекла. Каплю суспензии наносят на предметное стекло в начале прямоугольника и, наклоняя стекло, дают ей стечь в противоположную сторону. Препарат высушивают на воздухе.
На сухой препарат наливают смесь равных объемов гипертонического раствора хлорида натрия и танина; протравливание продолжают в течение 5 мин. Смесь сливают, осторожно промывают водой и докрашивают раствором розалинина 2-3 мин. Промывают водой, высушивают на воздухе.
Ожидаемый результат: у большинства бактерий толщина жгутиков не превышает 10-30 нм, т. е. жгутики находятся за пределами разрешающей способности обычного микроскопа. Поэтому в основе всех методов их выявления, в том числе и метода Лейфсона, лежит искусственное увеличение размеров жгутиков за счет нанесения протравы, что позволяет увидеть их при иммерсионной микроскопии.
При микроскопии демонстрационного препарата нужно обратить внимание не только на количество и характер расположения жгутиков, но и на морфологию изучаемой культуры.
Вопросы для самоконтроля:
1. Какой метод окраски является основным для изучения морфо-тинкториальных свойств бактерий и почему?
2. Обоснуйте, какие структуры (обязательные или необязательные) имеют дифференциально-диагностическое значение при изучении микроорганизмов.
3. Почему негативный метод является основным при выявлении капсул у бактерий. Назовите микроорганизмы, образующие макрокапсулы.
4. Как будет выглядеть препарат из культуры спорообразующих бактерий, окрашенный по методу Грама и почему?
5. Обоснуйте возможность использования спор бактерий для биологического контроля режима стерилизации автоклава.
6. Для каких бактерий выявление зерен волютина имеет дифференциально-диагностическое значение?
7. Какими косвенными методами можно выявить наличие жгутиков у микроорганизмов?
Литература:
Учебники:
2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 47-54, 257-260.
Лекции по микробиологии.
Тесты.