Есть множество свидетельств тому, что АФК играют роль «самурайского меча» в самоубийстве биологических систем различной степени сложности. Такого рода явления обнаруживаются уже у бактерий, где механизмы типа «токсин-антитоксин» в определенных случаях опосредованно вызывают смерть клетки в результате резкого подъема уровня АФК под действием свободного токсина. У дрожжей гибельное действие избытка феромона в конечном итоге приводит к вспышке генерации ROS в митохондриях. Самоубийство митохондрий также может осуществляться за счет вызванного АФК открытия пор во внутренней мембране этих органелл. Апоптоз и некроз клеток многоклеточных организмов сопровождается подъемом уровня АФК и открытием тех же митохондриальных пор. Органоптоз (исчезновение органа в процессе онтогенеза) хвоста головастика вызывается мощной продукцией перекиси водорода в клетках этого органа. Повышение уровня АФК с возрастом описано у дрожжей, мицелиевых грибов, растений, насекомых, млекопитающих. Смертоносное действие абсцизовой кислоты, образуемой семенами однолетних растений (см. выше, гл. 2), также опосредовано, по-видимому, активными формами кислорода.
В только что вышедшем обзоре Б.Л. Кирквуд и А. Ковальд так суммируют аргументы в пользу тезиса о том, что старение причинно связано с токсическим эффектом АФК: 1) АФК непрерывно образуются при дыхании во всех аэробных клетках; 2) они способны вызывать окислительные повреждения практически всех органических веществ; 3) такое повреждение действительно имеет место в организме и увеличивается с возрастом; 4) мутации, уменьшающие повреждения, вызываемые АФК, увеличивают продолжительность жизни организма; 5) описаны случаи пчел, то у них вероятность смерти экспоненциально растет с возрастом, у так же, как у всех стареющих существ.
И тем не менее в последнее время участились нападки на гипотезу Хармэна ввиду явных нестыковок, накапливающихся наблюдений и предсказаний ее простейшего варианта в духе «пессимистов», полагающих, что АФК случайно вызывают повреждение ДНК и белков, в чем собственно и состоит старение организма. Например, голый землекоп образует АФК быстрее мыши, а его антиоксидантная защита слабее мышиной и потому уровень окисления ДНК и белков оказывается явно выше, чем у мыши. Казалось бы, и жить землекоп должен меньше мыши. На самом деле, однако, он живет в лаборатории более чем в 10 раз дольше, чем мышь. Ключом к пониманию загадки голого землекопа может быть факт, установленный в лаборатории Р. Баффенстайн (именно ей мы обязаны важнейшим наблюдением о независимости смертности этого животного от его возраста). Оказалось, что добавление АФК к культуре клеток землекопа не вызывает их ухода в апоптоз. Если принять, что старение есть программа реализации смертоносного сигнала, носителем которого служит АФК, то у нестареющего голого землекопа, не испытывающего давления естественного отбора, она за ненадобностью отключена, поскольку уже не может способствовать эволюции. По-видимому, это отключение произошло где-то после АФК (например, на уровне открытия посредством АФК пор в митохондриальной мембране). Т.е. АФК образуются, но включить апоптоз и некроз они уже не могут, так что уменьшения «клеточности» тканей не происходит. Вот почему, как мы думаем, наблюдается парадоксальная ситуация, когда животное не стареет, несмотря на то что образует значительные количества АФК.
Возникает вопрос: почему в эволюции именно АФК были выбраны в качестве инструмента старения? Нет сомнений, что АФК, возникшие из-за резкого повышения 02 в атмосфере где-то около 2,5 миллиарда лет тому назад, все еще представляют собой проблему для современных аэробных форм жизни. Быть может, именно поэтому старение как специализированный механизм эволюции устроено таким образом, чтобы способствовать усовершенствованию антиоксидантной системы организма. В известном смысле АФК действуют наподобие лисы в приведенном выше примере улучшения заячьей породы (часть I, раздел 11.5.2), но отбор идет не на лучший интеллект, а на лучшую систему защиты от кислорода. Это обстоятельство — прямое следствие участия АФК в осуществлении программ самоликвидации митохондрий, клеток, органов и организмов.
Здесь уместно вспомнить также и о других, важных для жизнедеятельности функциях АФК, без которых жизнь современных организмов уже невозможна (см. часть I, раздел 1.6.1). Демонстративен пример с головастиками. Как отмечалось выше, их превращение в лягушек сопровождается массовым образованием АФК, вызывающих апоптоз клеток хвоста, что ведет к его исчезновению. В то же время если оторвать кусочек хвоста у молодого головастика, то для его регенерации требуется пролиферация клеток оставшейся части, причем это явление активируется посредством АФК. Таким образом, наряду с мрачной функцией АФК как участников самоубийства отдельной клетки или даже индивида эти же самые вещества оказываются жизненно необходимы для организма.
II.6.5. Откуда берутся активные формы 02
Вопрос о том, почему одни животные живут долго, а другие быстро умирают, т.е. о причинах длительности и краткости жизни, требует исследования.
Аристотель
«Длительность и краткость жизни» (350 г. до нашей эры)
Митохондрии суть главный объект вмешательств, которые призваны увеличить продолжительность жизни.
Дж. Леманн и соавторы
В клетке есть несколько мест, где образуется АФК. Это прежде всего митохондрии — органеллы, ответственные за поглощение почти всего кислорода, поступающего в организм через легкие. Митохондрии состоят из двух мембран (внешней и внутренней), межмембранного пространства и матрикса, отделенного внутренней мембраной от межмембранного. В каждой клетке очень много отдельных митохондрий. Из-за складчатости внутренней митохондриальной мембраны ее общая площадь у взрослого человека измеряется тысячами квадратных метров. И эта мембрана более чем наполовину состоит из белков-ферментов, катализирующих дыхание клетки и сопряженный с ним синтез АТФ — энергетической валюты живых существ. Именно ферменты дыхания служат одним из главных катализаторов превращения 02 в анион-радикал супероксид, из которого получаются другие АФК. В принципе, главная функция дыхательных ферментов митохондрий — это превратить 02 в безобидную воду. Но даже если небольшая часть поглощаемого митохондриями кислорода будет преобразована в супероксид, количество этого потенциально ядовитого вещества будет достаточно, чтобы натворить бед в нашем организме.
Митохондрии — потенциально главный (или один из главных) генератор АФК в клетках млекопитающих. Выполнение этого условия необходимо, но еще недостаточно для заключения, что именно митохондриальные АФК обусловливают медленное, нарастающее с годами отравление организма, которое мы называем старением. В пользу такой возможности говорят следующие факты.
1) Продолжительность жизни различных видов обратно пропорциональна продукции АФК в митохондриях. Митохондрии птиц образуют АФК медленней, чем митохондрии млекопитающих того же размера, имеющих гораздо меньшую продолжительность жизни. Подобные соотношения наблюдаются также между летучей мышью (вес 8 г, живет до 34 лет) и землеройкой (вес 25 г, живет 1-2 года). В лабораториях Р.С. Сохала, Г. Бархи и М. Бранда было независимо показано, что продолжительность жизни теплокровных тем короче, чем выше скорость генерации АФК при обратном переносе электронов через комплекс I дыхательной цепи сердечных митохондрий. Такой корреляции не наблюдалось, если измеряли генерацию АФК при прямом переносе электронов через тот же участок цепи. Особенно обстоятельной оказалась работа группы из Кембриджа (Англия), где исследовали 12 видов различных млекопитающих (от мыши до бабуина и коровы) и птиц (от перепелки до голубя) (Рис. II.6.4). 11 видов отлично легли на прямую, описывающую продолжительность жизни как обратную функцию от скорости генерации митохондриальных АФК. И только один вид оказался явным исключением из правила.
Это был голый землекоп, живущий по крайней мере в 10 раз дольше мыши, но образовывавший АФК быстрее, чем мышь. Однако это тот случай, когда исключение лишь подтверждает правило. Дело в том, что голый землекоп был единственным нестареющим существом в исследованной выборке видов.
Как уже отмечалось выше, у этого животного программа старения, по-видимому, блокирована где-то после АФК, что и объясняет его выпадение из описанной корреляции: АФК образуются, но уже не в состояний передать смертоносный сигнал дальше по цепочке событий, совокупность которых приводит к старению. Интересно сопоставление с этой точки зрения голого землекопа и летучей мыши. Оба имеют рекордную продолжительность жизни для столь мелких млекопитающих (более 30 лет), но у летучей мыши АФК образуются в митохондриях медленней, чем у короткоживущей мыши или землеройки, а у голого землекопа — быстрее. Создается впечатление, что программа старения у летучих мышей прервана до АФК, а у голого землекопа — после АФК. В данном отношении летучая мышь напоминает североамериканскую белоногую мышь Peromuscus leucopus. Этот родственник лабораторной белой мыши (они обе относятся к надсемейству Muridae), близкий к ней по размерам и физическому сложению, имеет сниженную н скорость образования АФК в митохондриях, повышенные активности т антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы) и меньший уровень окисленности липидов. Максимальная продолжительность жизни белоногой мыши — более 8 лет против 3,5 года лабораторной мыши. Соотношение генерации АФК митохондриями и продолжительности жизни для белоногой мыши, как и для лабораторной, отлично ложится на прямую, коррелирующую эти параметры для других животных.
Факты и соображения, изложенные выше, позволяют предполагать, что концентрация АФК в митохондриях должна с возрастом повышаться у стареющих организмов. Совсем недавно это было прямо подтверждено на дрозофиле М. Мерфи и сотрудниками, разработавшими элегантный метод измерения митохондриальных АФК in vivo с помощью проникающих катионов. Существенно, что на людях получены указания на увеличение с возрастом генерации АФК при обратном переносе электронов в мышечных митохондриях. Генерация Н202 митохондриями молодых людей (средний возраст 23,5 года) была почти втрое ниже, чем у пожилых (67,3 года), причем этот эффект блокировался ротеноном, ингибитором комплекса I.
2) Антиоксидантная защита митохондрий значительно снижается при старении.
Ключевую роль в этом эффекте играет падение уровня белка SIRT3 — фермента-деацетилазы, стимулирующего важнейшие антиоксидантные системы митохондрий — восстановление глютатиона и супероксиддис-мутазу 2.
3) Снижение уровня митохондриальных АФК замедляет старение. Такой эффект был достигнут тремя различными способами.
а) Каталаза, ключевой антиоксидантный фермент, расщепляющий Н202, был адресован в матрикс митохондрий, где он в норме отсутствует. Оказалось, что мыши с такой мутацией живут дольше. В той же лаборатории было показано, что старение скелетных мышц резко замедляется присутствием каталазы внутри митохондрий. Исчезли такие нарастающие с возрастом эффекты, как повышение продукции перекиси водорода мышечными митохондриями, увеличение числа мутаций митохондриальной ДНК, рост карбонилирования белков (особенно белков митохондрий), снижение максимальной скорости митохондриального дыхания и сопряженного с ним синтеза АТФ. Тормозилось уменьшение числа митохондрий в скелетных мышцах при старении животных. Кроме того, ослаблялось неблагоприятное действие старения на миокард, снижались явления системного вое- х паления, уменьшалась частота возникновения опухолей негематопо- 1 этического происхождения; при этом каталаза не влияла на развитие опухолей гематопоэтической системы и гломерулонефропатий. На мышах с мутацией в корректорском центре митохондриальной ДНК-полимеразы («мутаторных мышах») адресная доставка каталазы в митохондрии сердца уменьшала число делеций митохондриальной ДНК, карбонилирование белков и количество формы фермента эпоптоза — каспазы 3, повышенные у «мутаторных» мышей в отсутствие каталазы в органеллах. Перечисленные эффекты были выражены гораздо слабее или вовсе отсутствовали, если каталаза была снабжена ядерным либо пероксисомным адресом.
б) Был нокаутирован ген белка p66shc, комплексующегося с митохондриальным цитохромом и, по-видимому, разрешающего этому 0 цитохрому переносить электрон прямо На 02, образуя О2' Продолжительность жизни мышей выросла на 30%. Интересно, что выключение гена белка p66shc снижает окислительное повреждение как митохондриальной, так и ядерной ДНК in vivo в легких, печени, селезенке, коже, скелетных мышцах и почках, но не влияет на этот показатель в мозге и сердце. Подобная тканевая специфика полностью соответствует содержанию p66shc, которое минимально в мозге и сердце. Можно полагать, что эти два органа в значительной степени выведе- ^ ны из-под действия программы старения, по крайней мере, в той ее части, которая реализуется достаточно рано и опосредована белком
в) В нашей лаборатории был синтезирован низкомолекулярный антиоксидант, адресованный в митохондрии (SkQl, см. далее, гл.7). Это вещество продлевало жизнь грибов, растений, ракообразных, насекомых, рыб и млекопитающих, а также замедляло развитие большой группы старческих заболеваний и признаков.
4) Увеличение уровня митохондриальных АФК ускоряет старение. В рамках нашего проекта по борьбе со старением (гл. 7) один из его участников, президент Королевской академии наук Швеции Б. Кэннон и ее сотрудники провели опыты на «мутаторных» мышах. Как уже отмечалось выше, такие мыши умирают гораздо быстрее со всеми признаками прогерии — преждевременного старения. Эти эффекты резко ослаблялись добавкой митохондриального антиоксиданта SkQ1 в питьевую воду.
5) Старение сопровождается накоплением ошибок в митохондриальной ДНК и уменьшением количества митохондриального фосфолипида кардиолипина.
В соответствии с логикой, изложенной выше, максимальная продолжительность жизни млекопитающих оказалась в обратной зависимости от количества двойных связей и способности к перекисному окислению фосфолипидов печеночных митохондрий.
Другой пример того же рода дало сравнение пчелиной матки и рабочей пчелы, продолжительность жизни измеряются соответственно годами в первом случае и десятками дней — во втором. У рабочих пчел оказалось гораздо больше полиненасыщенных жирных кислот, подверженных перекисному окислению, а у маток — насыщенных, устойчивых к этой опасности. Наконец, количество белка-антиоксиданта, ювенильного гормона пчел вителлогенина было намного выше у маток.
6) Митохондриальные АФК вызывают апоптоз, тем самым способствуя уменьшению «клеточности» органов и тканей.
На сегодня накоплен обширный экспериментальный материал о том, как АФК участвуют в запрограммированной смерти клетки. В этом смысле особенно важны митохондриальные АФК. Мутантные клеточные линии, лишенные митохондриальной ДНК, а значит, и возможности образовывать АФК в дыхательной цепи, чрезвычайно устойчивы т к апоптозу. Митохондриальный антиоксидант SkQl блокирует апоптоз о клеток в культуре, вызванный небольшой добавкой перекиси водорода. Сама добавленная перекись быстро разлагается клеточными ферментами, но затем, через 1-2 часа, наступает мощный всплеск генерации эндогенных АФК, который как раз и снимается SkQl. Здесь мы имеем дело с явлением, обнаруженным нашим сотрудником Д.Б. Зоровым, а именно «образованием АФК под действием других АФК». Показано также снятие некроза клеток in vitro посредством SkQl. Кроме того, обнаружено предотвращение при помощи SkQl возрастной активации апоптоза крысиных фибробластов.
Таким образом, есть веские основания полагать, что именно митохондриальные АФК вызывают уменьшение количества клеток в органах и тканях стареющих организмов.